Kỹ thuật khuếch đại DNA đẳng nhiệt thông qua vòng LAMP- Loop Mediated Isothermal Amplification

Tác giả:  TS. Trần Thị Thanh Huyền

     LAMP là một phương pháp mới hiện đang được dùng phổ biến để chẩn đoán nhanh trong lĩnh vực sinh y học dựa trên khả năng tổng hợp một lượng lớn ADN mà không cần máy biến nhiệt được thực hiện bởi một ADN polymerase đặc biệt và ít nhất hai cặp mồi đặc hiệu. Bước đầu tiên của quá trình khuếch đại, bốn mồi được sử dụng để tổng hợp khuôn cho phản ứng LAMP từ gen đích, sau đó hai mồi được sử dụng cho mỗi chu kỳ. Toàn bộ quá trình khuếch đại đoạn ADN đích cần thời gian khoảng 40 đến 60 phút. Sản phẩm cuối cùng nhận được là các đoạn ADN kép dạng gấp khúc có kích thước gấp nhiều lần kích thước của đoạn gen cơ sở. Toàn bộ dung dịch sau phản ứng có thể quan sát được bằng mắt thường dưới sự thay đổi của các chỉ thị mà không cần điện di trên gel agarose. ADN polymerase thường được sử dụng trong các phản ứng LAMP là Bst ADN polymerase hoặc Bsm ADN polymerase có hoạt tính tự tách chuỗi cao. Do sử dụng 2-3 cặp mồi bắt cặp bổ sung với 6-8 đoạn trình tự trên gen đích nên phương pháp này có độ đặc hiệu và độ nhạy rất cao, có thể thu được kết quả tốt ngay ở nồng độ ADN thấp [81]. Oriel và cs năm 2010 đã công bố sử dụng phương pháp LAMP có thể phát hiện được gen rim và p150 của vi khuẩn Theileria parva ở giới hạn 1 fg [86], còn Chen đã công bố có thể phát hiện được gen rimM của vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis và Mycobacterium bovis ở giới hạn là 1 pg. Như vậy có thể thấy phương pháp LAMP có giới hạn phát hiện thấp hơn nhiều so với phương pháp PCR hoặc Real-time PCR nên có độ nhạy cao, cho kết quả chính xác hơn so với các phương pháp sinh học phân tử khác. Tuy nhiên, mồi dùng cho phản ứng LAMP lại phức tạp hơn mồi cho phản ứng PCR thông thường. Phản ứng LAMP cần phải sử dụng hai cặp mồi, một cặp có chiều dài khoảng 40 nucleotit và được thiết kế đặc biệt, cặp còn lại có chiều dài khoảng 20 nucleotit.

         Thêm vào đó, toàn bộ quá trình từ lúc khuếch đại gen đích và phát hiện sản phẩm phản ứng đều diễn ra trong 1 ống thí nghiệm ở điều kiện đẳng nhiệt. Ưu điểm của phương pháp này là có thể hạn chế sự nhiễm ADN ra khu vực xung quanh, điều mà phương pháp PCR không đảm bảo được do phải tiến hành điện di sản phẩm PCR và soi dưới máy UV. Như vậy, nếu sử dụng phương pháp LAMP thì không cần đến các thiết bị phòng thí nghiệm hiện đại và rất dễ dàng thao tác ở ngoài thực địa.

         So với các phương pháp chẩn đoán bệnh ở cá thông thường hiện nay chủ yếu dựa vào các dấu hiệu lâm sàng, phân lập và xác định tác nhân vi sinh vật gây bệnh bằng phương pháp vi sinh và hóa sinh hoặc sử dụng các kỹ thuật miễn dịch. Kỹ thuật PCR khuếch đại axit nucleic hiện đang rất phổ biến trong các phòng thí nghiệm với ưu điểm có thể phát hiện được tác nhân gây bệnh thông qua một lượng nhỏ ADN hoặc RNA. Đây được xem là kỹ thuật chính xác và nhạy nhưng lại thường đòi hỏi nhiều thiết bị phức tạp đi kèm và kỹ thuật viên thực hiện do đó việc ứng dụng phương pháp này ngoài thực địa bị hạn chế.

Một công cụ chẩn đoán phân tử mới được gọi là khuếch đại đẳng nhiệt có tạo thành các loop (LAMP) đã chứng minh được rằng: ADN có thể được khuếch đại ở điều kiện đẳng nhiệt mà không cần phải có chu trình nhiệt biến đổi như PCR. Không giống như PCR, ADN đích sử dụng trong phương pháp này không cần phải biến tính để tách chuỗi, lượng sản phẩm phản ứng sau khi được khuếch đại với một thời gian rất ngắn lại rất lớn và các phản ứng dương tính có thể phát hiện được bằng mắt thường thay vì phải điện di như phương pháp PCR. Ưu điểm của phương pháp này là rất đơn giản, chỉ cần một bể ổn nhiệt  hoặc một thiết bị gia nhiệt có khả năng duy trì nhiệt độ ổn định là có thể tiến hành phản ứng.

Phương pháp LAMP sử dụng một ADN polymerase và 4 mồi được thiết kế đặc hiệu dựa trên 6 trình tự khác biệt trên gen đích. Mồi trong có trình tự tương tự và bổ sung với trình tự mạch LAMP khởi đầu. Cặp mồi ngoài có khả năng tách chuỗi phân tử ADN cùng với sự hỗ trợ của Bst ADN polymerase có hoạt tính tách chuỗi cao tạo ra phân tử ADN mạch đơn. Sợi đơn này sau đó sẽ tạo thành cấu trúc dạng kẹp tóc tạo điều kiện khởi đầu cho phản ứng khuếch đại bởi LAMP.

Kỹ thuật LAMP có những ưu điểm mà kỹ thuật PCR không có được như :

  • Không đòi hỏi máy biến nhiệt đắt tiền như PCR bởi vì tất cả phản ứng diễn ra tại một nhiệt độ cố định, dao động từ 60- 65oC, tùy thuộc vào hàm lương GC trong mồi.
  • Kết quả có thể được đọc ngay bằng mắt thường sau khi phản ứng kết thúc mà không cần điện di trên gel agarose.
  • Thời gian thực hiện phản ứng rất ngắn, trong vòng 60 phút với giới hạn phát hiện cao hơn kỹ thuật PCR.
  • Sự khuếch đại đặc hiệu cao vì có đến 2-3 cặp mồi nhận biết 6-8 vùng riêng biệt trên ADN khuôn.
  • Trong phương pháp LAMP lượng ADN tổng hợp được lớn hơn gấp nhiều lần so với PCR.
  • Phương pháp LAMP có thể thực hiện khuếch đại RNA bằng cách bổ sung thêm enzym phiên mã ngược vào trong hỗn hợp phản ứng.
    1.  

1. Nguyên lý thiết kế mồi cho phản ứng LAMP

            Phản ứng LAMP muốn hoạt động cần có sự tham gia của 2 cặp mồi: một cặp mồi ngoài và một cặp mồi trong. Cả 4 mồi này ban đầu đều được sử dụng để tạo sợi khởi đầu cho phản ứng LAMP. Sau đó, cặp mồi trong được sử dụng cho phản ứng khuếch đại ADN. Cặp mồi ngoài được gọi là F3 và B3 và cặp mồi trong được gọi là: mồi xuôi trong FIP và mồi ngược trong BIP. Bộ 4 mồi được thiết kế dựa trên 6 vùng khác nhau của ADN đích: Vùng F3c, F2c, F1c ở đầu 3’ và Vùng B1, B2, B3 ở đầu 5’.

                                            

 Hình 1. Nguyên tắc thiết kế mồi cho phản ứng LAMP

        Cả 2 mồi trong đều gồm 2 đoạn trình tự khác nhau bổ sung với sợi khuôn và sợi đối khuôn trên phân tử ADN đích, trong đó 1 trình tự dùng cho giai đoạn khởi đầu chu kỳ khuếch đại và một trình tự dùng cho quá trình tự mồi(LF) và mồi loop ngược (LB) có thể làm tăng hiệu quả của phản ứng LAMP. Nhiệt độ Tm của mồi F1c và B1c thường phải cao hơn so với mồi F2 và B2 để có thể tạo được cấu trúc loop. Nhiệt độ Tm của mồi ngoài F3 và B3 thì lại phải thấp hơn so với mồi B2 và F2 để đảm bảo rằng mồi trong có thể bắt đầu quá trình tổng hợp sớm hơn so với các mồi ngoài. Thêm vào đó, nồng độ của các mồi trong bao giờ cũng phải cao hơn so với các mồi ngoài. Nồng độ mồi ngoài chỉ nên bằng ¼ đến 1/10 nồng độ mồi trong. Đây là điểm mấu chốt để phản ứng LAMP có thể tạo thành cấu trúc khởi đầu sao chép dạng quả tạ. Kích thước của các vòng loop được tạo thành giữa F2c và F1c cũng như giữa B2c và B1c thích hợp nhất là khoảng 40 nucleotit hoặc dài hơn. Kích thước của gen đích cũng có ảnh hưởng quan trọng đến hiệu quả của phản ứng bởi đây là quá trình tự sao chép ADN.

2.  Cơ chế khuếch đại của phản ứng LAMP

LAMP là phản ứng tự tách chuỗi và tự tổng hợp ADN ở nhiệt độ cố định từ 60-65oC trong khoảng thời gian từ 45-60 phút với sự có mặt của Bst ADN polymerase, dNTPs, các cặp mồi đặc hiệu và sợi ADN khuôn. Có thể chia phản ứng LAMP thành 2  giai đoạn: Không theo chu kỳ và theo chu kỳ.

Giai đoạn không theo chu kỳ tổng hợp cấu trúc khởi đầu sao chép:

Bước 1: Ở nhiệt độ khoảng 65oC, một trong số các mồi có thể tương tác với trình tự bổ sung trên ADN đích, khởi đầu quá trình sao chép ADN sử dụng ADN polymerase có hoạt tính tách chuỗi cao.

                               

Bước 2: Ban đầu, mồi FIP bắt cặp với đoạn F2c trên sợi khuôn và khởi đầu quá trình tổng hợp sợi bổ sung từ đầu 3’ F2 của FIP tạo thành một sợi ADN kép có đầu F1c tự do không bổ sung với sợi khuôn.

                               

Bước 3: Mồi ngoài F3 bắt cặp với đoạn F3c trên sợi ADN khuôn, phía bên ngoài đoạn F2 và khởi đầu quá trình tổng hợp sợi bổ sung mới.

                                

Bước 4-5:   Một sợi ADN kép mới được tạo thành gồm sợi khuôn và sợi được tổng hợp bằng mồi F3, do đó giải phóng ra sợi bổ sung ban đầu được tổng hợp bằng mồi FIP có trình tự F1 và F1c bổ sung với nhau nên tạo thành 1 loop ở đầu 5’ (5).

 

                                

                                

Sợi đơn Bước 6:(5) này đóng vai trò làm khuôn để tổng hợp sợi ADN mới bằng mồi BIP và sau đó tổng hợp sợi thay thế bằng mồi B3.

                                           

        Ban đầu BIP có trình tự B2 bắt cặp bổ sung đoạn B2c ở đầu 3’ trên sợi đơn ADN khuôn và tổng hợp sợi bổ sung. Trong quá trình này sợi khuôn từ dạng vòng ở đầu 5’ trở lại thành dạng thẳng.

        Mồi B3 bắt cặp với B3c phía ngoài BIP, dưới tác dụng của ADN pol tại đầu 3’ sợi ADN (được tổng hợp từ BIP) sẽ bị thay thế và giải phóng ở dạng sợi đơn.

Một sợi kép mới được tạo thành do sự bắt cặp bổ sung của sợ khuôn

Bước 7. Một sợi kép mới được tạo thành do sự bắt cặp bổ sung của sợ khuôn (5) với đoạn mới được tổng hợp bởi mồi B3 ở đầu 3’

                                              

Bước 8: Sợi đơn liên kết với BIP sau khi được giải phóng ở bước 6 sẽ tạo thành 1 vòng ở đầu 5’ do sự bắt cặp bổ sung của B1 và B1c và 1 vòng ở đầu 3’ do sự bắt cặp bổ sung của F1 và F1c tạo thành cấu trúc giống hình quả tạ. Cấu trúc này là cấu trúc khởi đầu cho chu trình khuếch đại bằng LAMP.

 

                                              

Giai đoạn theo chu kỳ: tự mồi và kéo dài chuỗi

Bước 8-11: Cấu trúc ADN hình quả tạ (8) lúc này sẽ diễn ra 2 sự tự mồi để tổng hợp ra 2 sợi bổ sung với trình tự đích:

          Một là:  mồi FIP có trình tự F2 bổ sung với F2c sẽ bám vào loop bên trái tổng hợp 1 sợi bổ sung. 

          Hai là: mồi F1 ở đầu 3’ của (8) sẽ tự mồi tạo ra sợi bổ sung mới có đầu 3’ sẽ tạo thành loop mới do sự bắt cặp bổ sung của B1c và B1. Lúc này sợi ADN mới gồm có 2 sợi giống nhau cùng bổ sung với sợi đích (9). Do có B1 ở vị trí 3’ nên mồi B1 tiếp tục tự mồi tạo ra sợi ADN tương tự với sợi đích (8) và giải phóng sợi bổ sung do FIP tổng hợp ban đầu (11) có dạng quả tạ do sự bổ sung của F1-F1c và B1c-B1, trình tự của sợi khuôn 11 này bổ sung với sợi khuôn (8) ban đầu.

          Tương tự vậy, sợi ở cấu trúc (11) sẽ được dùng làm khuôn để khởi đầu 2 quá trình tự mồi song song bằng mồi B1 ở đầu 3’ và mồi BIP bám vào đoạn B2c và bắt đầu sự tổng hợp ADN thay thế mạch, giải phóng đoạn ADN do B1 mồi. Theo đó, cấu trúc tương tư như ở bước (9) và (10) cũng như giống cấu trúc do bước (8) tạo thành. Với cấu trúc tạo thành ở bước (10), BIP bám vào đoạn mạch đơn B2c, sự tổng hợp ADN tiếp tục bởi sự thay thế đoạn mạch đôi ADN.

          Kết quả của quá trình này là nhiều cấu trúc ADN kép bao gồm các trình tự lặp đi lặp lại luân phiên đảo ngược trình tự đích được ngăn cách với nhau bởi các loop trong cùng một sợi trên 1 phân tử ADN kép (Hình 2).

 

Hình 2. Nguyên lý khuếch đại ADN của phản ứng LAMP

 

Dưới đây là video quá trình khuếch đại ADN bằng phương pháp LAMP https://www.youtube.com/watch?v=ZXq756u1msE

 

 

 

 

 

 

 

Hiển thị tất cả kết quả cho ""